Уште од самиот почеток на пандемијата, секако и според постоечките информации – се знаеше за точноста на ПЦР тестовите кои без малку го дефинираа текот на пандемијата. Нивната улога беше од огромно значење, бевме сведоци на секојдневно броење на позитивни случаи, без разлика дали некој има КОВИД 19 или не. Но, сега со новите информации (кои ги потврдуваат постарите), се јавува уште едно прашање: Колку всушност се точни клиничките истражувања за ефикасноста на вакцините против САРС-КоВ-2?
Нова студија проценува 42% лажна стапка на откривање на SARS-CoV-2 со PCR тестовите, што укажува на неважење на податоците од клиничките испитувања на вакцината за КОВИД-19.
Автор: Џереми Р. Хамонд, извор
Проблемот на лажно позитивните резултати од PCR тестот
Од појавата на КОВИД-19 и прогласувањето на глобална пандемија во март 2020 година, ПЦР тестовите се широко користени за да се идентификуваат „случаите на КОВИД-19“. Сепак, познато е дека тестовите честопати даваат позитивен резултат за луѓе кои немаат активна инфекција со SARS-CoV-2, корона вирусот што ја предизвикува болеста. Тестовите се дизајнирани да детектираат фрагменти од вирусна РНК и не докажуваат присуство на цел жив вирус, така што тестовите може да бидат позитивни за луѓето кои немаат активна инфекција.
Тестовите за реверзна транскрипција на квантитативна полимеразна верижна реакција (RT-qPCR), попознати едноставно како PCR тестови, работат со обратна транскрипција на вирусна РНК во ДНК и потоа циклично засилување на генетскиот материјал до забележливо ниво. Бројот на циклуси потребни за да се достигне прагот за позитивност е прокси мерка за „вирусно оптоварување“: помал број циклуси укажуваат на поголема количина на вирусна РНК во примерокот, додека поголем број циклуси укажуваат на помала количина на вирусна РНК .
Фактот дека многу луѓе се бројат како „случаи со КОВИД-19“ и покрај тоа што ја немаат болеста, па дури и инфекција, беше признаен за време на интервјуто во јули 2020 година од д-р Ентони Фаучи, директорот на Националниот институт за алергии и заразни болести (NIAID) под Националниот институт за здравство (NIH), главен медицински советник на претседателот и член на Работната група за корона вирус во Белата куќа.
Еден начин да се потврди присуството на одржлив вирус е да се користи клеточна култура за да се набљудуваат цитопатските ефекти и вирусната репликација. Ако добиете праг на циклус од 35 или повеќе со PCR тест, објасни Фаучи, „шансите тој да биде компетентен за репликација се мали“. Со толку високи вредности на прагот на циклусот (Ct), рече тој, „речиси никогаш не можете да го култивирате“ вирусот.
Како што е слично објаснето во една статија објавена во Nature Medicine на 18 јуни 2020 година, вирусното оптоварување заклучено од бројот на циклуси потребни за да се достигне прагот на позитивност „не се поистоветува со вирусна инфективност и потребна е понатамошна евалуација за да се утврди вирусно оптоварување на САРС ‑КoВ‑2 кое е во корелација со вирус кој може да се понатаму култивира“.
Но, тоа никогаш не беше направено. ПЦР тестовите се користеа за дијагностицирање на „КОВИД-19“ дури и во отсуство на симптоми и без каква било потврда дека активен SARS-CoV-2 вирус бил присутен во примерокот од пациентот. Систематската злоупотреба на ПЦР-тестовите за броење на луѓе кои немале инфекција и не биле заразни како „случаи на КОВИД-19“ беше прифатена во написот на Њујорк Тајмс на 29 август 2020 година, со наслов „Вашиот тест за коронавирус е позитивен. Можеби не треба да биде“. Како што објави „Тајмс“, тестовите се користеа со толку висок праг што „до 90 отсто од луѓето кои се позитивни на тестот“ „нема веројатност да бидат заразни“. Сепак, лажните „проверувачи на факти“ на медиумите го задржаа лажното тврдење дека позитивниот ПЦР тест нужно значел дека тестираната личност е „случај на КОВИД-19“. На социјалните мрежи, луѓето беа цензурирани затоа што ја кажаа вистината дека систематската злоупотреба на PCR тестовите беше пристрасна при броењето на случаите.
Освен откривање на неодржливи фрагменти на РНК од SARS-CoV-2, PCR тестовите може да дадат лажно позитивни резултати поради „бучава во позадината“, како што е објаснето од Светската здравствена организација (СЗО) во предупредувањето за медицински производ на 14 декември 2020 година. Иако овој документ беше отстранет од веб-страницата на СЗО кон крајот на јануари 2021 година, документот го призна проблемот со „покачен ризик за лажни резултати на SARS-CoV-2“ од PCR тестовите.
Доколку преваленцата на инфекцијата со САРС-КоВ-2 е ниска, „се намалува и позитивната предиктивна вредност“ на тестовите, што значи дека „веројатноста лицето кое има позитивен резултат . . . да е вистински инфициран со SARS-CoV-2 се намалува како што се намалува стапката на позитивност, без оглед на специфичноста на анализата. Затоа, давателите на здравствени услуги беа „охрабрени да ги земат предвид резултатите од тестирањето заедно со клиничките знаци и симптоми“.
Со други зборови, позитивниот PCR тест не треба да се користи како единствена основа за дијагностицирање на „КОВИД-19“. Рутинското тестирање, вклучително и асимптоматски поединци, сигурно ќе предизвика зголемување на бројот на случаи со КОВИД-19. СЗО дополнително предупреди на потребата „да се утврди дали е неопходно рачно прилагодување на прагот на позитивност на PCR за да се земе предвид каква било бучава во позадина што може да доведе до тоа дека примерокот со вредност на прагот на висок циклус (Ct) се толкува како позитивен резултат“. Во некои околности, „тешко е да се утврди разликата помеѓу бучавата во позадина и вистинското присуство на целниот вирус“. Затоа, во некои случаи, „исклучувањето треба рачно да се прилагоди за да се осигура дека примероците со високи вредности на Ct не се погрешно доделени на SARS-CoV-2 и откриени поради бучава во позадината“.
Во ажурираната верзија на предупредувањето за медицински производи објавено на 13 јануари 2021 година, СЗО потсети на потребата од „внимателно толкување на слабите позитивни резултати“, особено во светлината на тоа како „преваленцата на болеста ја менува предвидувачката вредност на резултатите од тестот; како што се намалува преваленцата на болеста, ризикот од лажно позитивни се зголемува“. ПЦР тестовите треба да се користат како „помош за дијагноза“, а не како единствена основа за означување на лице како случај на КОВИД-19.
Предупредувањето за медицински производ упатуваше на привремен документ за упатство за дијагностичко тестирање за SARS-CoV-2 објавен од СЗО на 11 септември 2020 година. СЗО во тој документ слично нагласи дека одлуката за тестирање „треба да се заснова и на клинички и на епидемиолошки фактори “, истакнувајќи дека постоелo „ризик од лажно позитивни или лажно негативни резултати од SARS-CoV-2“. Според дијаграмот на тек презентиран во документот за упатството, треба да се тестираат само пациенти кои се појавуваат со клиничка болест, а резултатите од тестот треба внимателно да се толкуваат бидејќи PCR тестовите може да „произведат лажни сигнали при високи вредности на Ct“. СЗО дополнително советуваше дека позитивните резултати од ПЦР тестовите може да се поддржат со секундарно тестирање со алтернативен ПЦР тест, или позитивниот резултат може да се потврди „преку секвенционирање на вируси“. Геномското секвенционирање е попрактична алтернатива од вирусната изолација во клеточна култура, за што е потребен обучен персонал и лаборатории за биосигурност од трето (BSL-3).
Уште претходниот привремен документ за упатство на СЗО за лабораториско тестирање на SARS-CoV-2, објавен на 19 март 2020 година (осум дена по прогласувањето на КОВИД-19 пандемија), на сличен начин нагласи дека одлуката за тестирање „треба да се заснова на клинички и епидемиолошки фактори и поврзани со проценка на веројатноста за инфекција“. Единствената ситуација во која СЗО советуваше тестирање на асимптоматски индивидуи беше ако тие имале јасна изложеност на вирусот од некој што се јавил со клиничката болест. ПЦР тестовите треба да се користат за „потврда“, а не како единствена основа за дијагностицирање на КОВИД-19, а резултатите од тестот треба дополнително да се потврдат „со секвенционирање на нуклеинска киселина кога е потребно“. СЗО советуваше дека, во области со ниска преваленца, позитивен тест може да се потврди „со секвенционирање на делумниот или целиот геном на вирусот“.
За да разберете зошто процентот на лажно позитивни резултати ќе се зголемува со намалувањето на преваленцата, еве две корисни видеа, првото е општ преглед на „Бејсовата теорема“, а второто ја применува теоремата конкретно за тестовите за КОВИД-19:
Не е направена валидација со златен стандард на PCR тестовите
Американскиот регулаторен систем претходно ја воспостави употребата на секвенционирање како метод на златен стандард за валидација за резултатите од PCR тестовите, како што е забележано во новата студија во списанието Science, Public Health Policy, and the Law, публикација на Институтот за чисто и применето знаење (Institute for Pure and Applied Knowledge – IPAK), основано од д-р Џејмс Лајонс-Вајлер. Автор на студијата е д-р Син Ханг Ли, патолог и директор на лабораторијата за молекуларна дијагностика Милфорд во Конектикат. Објавен на 31 октомври, трудот е насловен „Евалуација на ПЦР дијагностика заснована на докази за САРС-КоВ-2 и варијантите на Омикрон според секвенционирањето на Gold Standard Sanger“.
По епидемијата на САРС во 2002 година, Американската агенција за храна и лекови (FDA) и Aмериканскиот центар за контрола и превенција на болести (CDC) воспоставија протокол за валидација на резултатите од ПЦР тестовите за да утврдат дали пациентите со симптоми се заразени со новиот корона вирус кој ја предизвикал болеста. Како што објаснува д-р Ли, ЦКБ препорача секвенционирање „за да се потврди автентичноста на засилениот производ“. АХЛ го потврди овој пристап според златниот стандард во документот за упатство од јануари 2009 година за употреба на PCR тестови при откривање на ентеровирусна РНК.
Како што објаснува Ли:
„Спротивно на претходно воспоставениот протокол и упатства поставени од ЦКБ и АХЛ за дијагноза на SARS-CoV-2 и за РНК вируси, комерцијалните комплети за анализа RT-qPCR на SARS-CoV-2 генерираат Ct број, недокажана замена за нуклеотидна секвенца, за „претпоставено квалитативно откривање на нуклеинска киселина од 2019‑nCoV [подоцна преименуван во SARS‑CoV‑2]“ под одобрение за итна употреба“.
Во претходна студија, објавена во Меѓународниот весник за геријатрија и рехабилитација во јули 2020 година, Ли го искористи препорачаниот пристап за проверка на резултатите од PCR тестот со секвенционирање. за повторно тестирање на дваесет референтни примероци обезбедени од Стејт департментот за јавно здравје во Конектикат. Тој откри дека 20 проценти од примероците класифицирани како негативни со ПЦР тестот на ЦКБ биле всушност позитивни за САРС-КоВ-2, додека 30 проценти од примероците класифицирани како позитивни биле всушност негативни.
Како што коментира Ли во весникот:
„Користењето на нуклеотидно секвенционирање за да се потврди секој позитивен PCR ампликон практично ги елиминира сите лажно-позитивни резултати. За навремена точна молекуларна дијагноза и карактеризација на инфективните агенси, загрижените научници повикуваат да се донесат микробиолошки секвенци во болничките лаборатории за да се подобри здравјето на поединецот и населението. . . . Познато е дека RT-qPCR тестовите генерираат и лажно-негативни и лажно-позитивни резултати. Високо чувствителни и прецизни лабораториски тестови за САРС-КоВ-2 се потребни за одредени популации, особено за луѓето во напредна возраст кои живеат во установи за долготрајна нега и за лицата кои се грижат за нив. Пациентите со лажно-негативни резултати од тестот може да го пренесат вирусот на семејството, пријателите или старателите. Неинфицираните жители во установи за долготрајна нега со лажно-позитивни резултати може да бидат изолирани во соби со пациенти со Ковид-19, што ги става во ризик да станат вистински позитивни. Пациентите кои се опоравуваат во болница мора да бидат тестирани со исклучително чувствителен, без лажно позитивен тест на нуклеинска киселина пред да бидат отпуштени во заедниците“.
Во друга студија, објавена јуни 2021 година во COVID-19 Pandemic: Case Studies & Opinions, д-р Ли објасни: RT-qPCR за молекуларно откривање на SARS-CoV-2 во примероци од човечки респираторен тракт е инхерентно погрешно. . . . PCR е алатка измислена за да обезбеди шаблони за анализа на секвенционирање на ДНК. Флуоресцентниот сигнал генериран во RT-qPCR не е сигурна маркер замена за ДНК секвенцата на целниот шаблон. . . . Добро е познато дека разликата помеѓу „бучавата во позадината“ и вистинското присуство на целниот вирус понекогаш е многу тешко да се утврди само со RT-qPCR анализа. Треба да се користи рутинско парцијално секвенционирање на генот SARS-CoV-2 за да се подобри дијагностичката точност, како што советуваше СЗО.
Стапка на лажно позитивни резултати од 42% за PCR тестовите
Во својата нова студија, д-р Ли користел Сангер секвенционирање за да преиспита педесет референтни примероци земени од пациенти во текот на јануари 2022 година кои биле позитивни на SARS-CoV-2 со анализа на RT-qPCR. Тој откри дека SARS-CoV-2 е откриен со PCR и Sanger секвенционирање само во дваесет и девет од педесетте примероци – лажно позитивна стапка од 42 проценти за дадените референтни примероци. Една од причините за бучавата во позадина, објаснува Ли, е дека „хибридизацијата на PCR прајмер/шаблон не е целосно специфична за секвенцата бидејќи PCR прајмерите може да се прикачат на нецелни ДНК и да ги засилат несаканите ДНК ако овие ДНК се присутни и делумно се совпаѓаат со прајмерите во нуклеотидната секвенца. . Како резултат на тоа, потпирањето на PCR, особено на технологијата qPCR со користење на Ct броеви како замена за вистинска анализа на PCR производ, за дијагноза на болеста е обврзана да генерира лажни позитиви“.
Имаше „општа претпоставка“ дека PCR прајмерот „проширува соодветен, но не и неусогласен нуклеотид“, забележува Ли, но ова е „неточно“.
Како пример, тој наведува дека „се покажа дека обратно вгнезден PCR прајмер на генот N на SARS-CoV-2 иницира PCR засилување на сегмент од генот на човечкиот хромозом 1 поради совпаѓање со 6-бази во неговиот 3′ крај со човечка геномска секвенца, механизам кој може да придонесе за 21 RT‑qPCR лажно-позитивни референтни примероци“.
Тој дополнително коментира:
„Нецелното засилување на ДНК со PCR беше јасно демонстрирано на сликите 18-21, во кои беше пронајден сет на PCR прајмери за засилување на пократок ДНК сегмент наместо целосно усогласениот подолг целен шаблон кога пократкиот ДНК сегмент нуди 9-базна секвенца што одговара на 3′ терминалната секвенца на PCR прајмерот. PCR секогаш претпочита засилување на пократки шаблони кога постои таква опција“.
Неговите наоди покажаа дека „RT-qPCR генерира значителен број лажно-позитивни резултати од тестот во сегашната фаза на КОВИД 19 пандемијата“, кој проблем може да се надмине со рутинско следење на производите на PCR со секвенционирање на ДНК.
Тој резимира:
„Недостатокот на RT-qPCR како дијагностичка анализа е тоа што зависи од одреден број, кој може да варира од лабораторија до лабораторија и од тест до тест, за да се направи разлика помеѓу позитивните и негативните резултати од тестот. Аналитот на PCR е сегмент од целната ДНК, чие присуство може да се потврди само со демонстрација на неговата нуклеотидна секвенца“.
Ли забележува дека за дијагноза со користење на PCR тестови на други заразни болести, вклучително и мајмунска сипаница, ЦКБ користи построг стандард:
„Користејќи qPCR за дијагноза на заразни болести, како што се инфекциите со вирусот на мајмунски сипаници, ЦКБ бара од лабораториите за тестирање да воспостават своја позитивна контролна гранична вредност на Ct или да подготват стандардна крива со цел да се идентификуваат примероците кои се навистина позитивни на вирусна ДНК од мајмунски сипаници. Сепак, не е поставено такво барање за SARS-CoV-2 RT-qPCR анализите. Како резултат на тоа, дијагностичките лаборатории немаат потврдена квантитативна стандардна крива или потврдена гранична вредност на Ct за SARS-CoV-2 RT-qPCR тестови; граничните вредности се разликуваат од лабораторија до лабораторија. Во некои околности, разликата помеѓу бучавата во позадина и вистинското присуство на целниот вирус е тешко да се утврди во овие RT-qPCR анализи; стапката на лажно откривање од 42% во SARS-CoV-2 RT-qPCR анализите не е неочекувана. Потребата за потврден тест со 100% специфичност веќе беше препознаена од сегашниот директор на ЦКБ пред 2 години“.
Ли продолжува да објаснува дека една импликација на овој резултат е дека проценките за ефикасноста на вакцините од клиничките испитувања за КОВИД 19 вакцините се неверодостојни. Испитувањата беа дизајнирани да ја одредат ефикасноста на вакцината против симптоматска инфекција, при што случајот беше дефиниран со еден или повеќе симптоми плус позитивен PCR тест. Како што забележува Ли, „Користењето RT‑qPCR тестови со лажно-позитивни резултати за да се оцени крајната точка во развојот на КОВИД 19 вакцината може вештачки да ја надуе ефективноста на вакцината. . . . Без потврдно Sanger секвенционирање на RT‑qPCR производите, тврдењето дека BNT162b2 [вакцината Pfizer-BioNTech COVID-19] е 95% ефикасна против КОВИД19 станува сомнителна.
Импликациите од студијата на д-р Ли се дополнително разјаснети во статијата на Substack од д-р Џејмс Лајонс-Вајлер, извршен директор на ИПАК и главен уредник на списанието Science, Public Health Policy & the Law. Претпоставувајќи стапка на преваленца од 5 проценти за инфекции со SARS-CoV-2 кај популацијата, стапката на лажно откривање на PCR тестовите од 42 проценти значи дека на секои 50 вистински позитивни резултати, ќе има 36 лажно позитивни резултати. Бројот на „случаи со КОВИД-19“ пријавени врз основа на ПЦР тестирање ќе биде преценет со фактор од 72 проценти.
Со оглед на таквата несигурност на PCR тестовите, „Нема веродостојни податоци за тестирање на КОВИД вакцината. . . . Објавената ефикасност на вакцините SARS-CoV-2, објавената стапка на инфицирани вакцинирани, објавените проценки за стапката на повторна инфекција – сето тоа е потенцијално ѓубре со оглед на стапката на лажни откритија од 42%. Не постојат веродостојни податоци за ефикасноста или ефективноста во реалниот свет на вакцините насочени кон SARS-CoV-2“.
Лајонс-Вајлер, исто така, коментира за тоа како ЦКБ и АХЛ не успеале да ги следат нивните сопствени упатства за воспоставување на Сангер секвенционирање како метод на златен стандард за проверка на резултатите од тестот за ПЦР:
„Причините зошто ова беше напуштено мора да се испитаат на сослушување во Сенатот. АХЛ го назначи секвенционирањето како ‘сложена’ процедура, а сепак д-р Ли нѐ потсетува дека секоја болница може да спроведе Сангер секвенционирање. . . . Всушност, во неговата студија, тој советува болниците да развијат свој капацитет за тестирање со Сангер секвенционирање и да не чекаат одобрение од АХЛ. Д-р Ли има развиено сет на прајмери што секоја болница може да ги користи и ги објави во извештајот“.
Во следната статија која дополнително ги дискутира импликациите на таквата висока стапка на лажни откритија во ситуации со мала преваленца, Лајонс-Вајлер забележува:
„Кога ЦКБ започна и АХЛ го одобри PCR тестирањето без начин да се процени прагот на основниот циклус (Ct; за секој пациент, секој пат), тие нè поставија за иднина со неприфатливо високи лажни стапки на откривање. . . . При секоја стапка на лажни откритија што не е блиску до нула, при ниска преваленца масовното тестирање ќе биде катастрофа бидејќи лажните позитиви значително ќе ги надминат вистинските позитивни“.
Клиничките испитувања беа спроведени кај популации „кои имаа многу ниска преваленца“ и затоа „исходите од испитувањата во однос на бројот на случаи во вакцинираните групи и бројот на случаи во невакцинираните групи се лажни“.